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注意事項：1．基礎程序；2．擴增溫度和延伸溫度；3．反應時間；4．循環次數；5．PCR 反應液的配制；6．PCR技術的基本原理；7．PCR的反應動力學；8．PCR擴增產物；9．PCR反應體系與反應條件。

實(shi)驗過程：
一(yi)、試劑(ji)準備
1. DNA模(mo)板(ban)
2．對應(ying)目(mu)的(de)(de)基因的(de)(de)特異引(yin)物(wu)（在PCR反應(ying)中(zhong)，新合(he)(he)成(cheng)的(de)(de)DNA是(shi)要(yao)接在一小(xiao)段(duan)序列上才能繼續按照(zhao)模(mo)板DNA復制(zhi)，而不(bu)(bu)能從無(wu)到有，憑空合(he)(he)成(cheng)。這(zhe)一小(xiao)段(duan)序列就(jiu)是(shi)你(ni)所要(yao)有設(she)(she)計(ji)(ji)的(de)(de)引(yin)物(wu)。可(ke)以是(shi)DNA也可(ke)以是(shi)RNA，一般20多bp，需(xu)要(yao)根據你(ni)的(de)(de)模(mo)板鏈設(she)(she)計(ji)(ji)。因此，擴增不(bu)(bu)同(tong)的(de)(de)基因需(xu)要(yao)設(she)(she)計(ji)(ji)不(bu)(bu)同(tong)的(de)(de)引(yin)物(wu)）
3．10×PCR Buffer
4．2mM dNTPmix：含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2mM
5．Taq酶(mei)
二(er)、操作步驟
1．在冰浴中，按以下次序將各成分加入(ru)一無菌0.5ml離心管中。
10×PCR buffer             5μl
dNTP mixl                 4μl
引物1（10pM）    ;           2μl
引物2（10PM）              2μl
Taq酶(mei)（2U/μl）            1μl
DNA模(mo)板(ban)（50ng-1μg/μl）　　　 1 μl
加ddH2O至               50 μl
視PCR儀有無熱蓋，不加或添加石蠟油。
2．調整好反應程序。將上述混合(he)液稍(shao)加離心，立即置(zhi)PCR儀(yi)上，執行擴增(zeng)。一般：在93℃預(yu)變性3-5min，進入循(xun)環(huan)擴增(zeng)階段：93℃ 40s → 58℃ 30s → 72℃ 60s，循(xun)環(huan)30-35次，zui后在72℃ 保(bao)溫7min。
3．結(jie)束反應，PCR產物放(fang)置于(yu)4℃待電泳檢測或-20℃長期保存。
4．PCR的電泳檢測(ce)：如在反(fan)應管(guan)中加(jia)有石(shi)蠟油，需用100μlLuFang進(jin)行抽(chou)提反(fan)應混合液(ye)，以除(chu)去石(shi)蠟油；否則，直接(jie)取5-10μl電泳檢測(ce)。
三、注意(yi)事項
１．PCR反應應該在一個沒有DNA污染的干凈環境中進行設立一個的PCR實驗室。
２．純(chun)化模板(ban)所選(xuan)用的(de)方(fang)法(fa)對(dui)污(wu)染的(de)風險有極(ji)大影響。一(yi)般而言，只要能(neng)夠得到可(ke)靠的(de)結果，純(chun)化的(de)方(fang)法(fa)越簡單越好。
３．所有(you)試劑(ji)都應(ying)該沒有(you)核酸和核酸酶的污(wu)染(ran)。操作過程中均應(ying)戴手套。
４．PCR試劑配制應使用zui高質量的新鮮雙蒸水，采用0.22μm濾膜過濾除菌或高壓滅菌。
５．試(shi)劑(ji)都(dou)應該(gai)以大體(ti)積配制，試(shi)驗一下(xia)是(shi)否滿(man)意，然后分裝成僅夠一次使(shi)用的量(liang)儲存，從而(er)確(que)保(bao)實驗與(yu)實驗之間的連續性。
６．試劑(ji)或樣(yang)品準(zhun)備(bei)過程中都要使用一次性(xing)滅菌的塑料瓶和管子(zi)，玻璃器皿應洗滌(di)干凈并高壓滅菌。
７．PCR的樣品應在冰浴上化開，并且要充分混勻。檢測步驟：
一、 試劑的準備
從試劑盒中取出熒光PCR反應液(BC-qPCR MIX)、酶混合物(Enzymes MIX)，冰上融化并振蕩混勻后，10000rpm離心10s。
設所需要的PCR反應管管數為N(N=樣本數+1管陰性對照+1管陽性對照)，每個測試反應體系配制如下表：
試劑 每個反應加入的量 N個反應加入的量
熒光PCR反應液 14µL N×14µL
酶混合物 1 µL N×1 µL
總量 15 µL N×15µL
（1） 計算好各試劑的使用量，加入一適當體積潔凈離心管中，充分混勻，10000rpm離心10s，向設定的N個PCR反應管中分別加入15μL熒光PCR反應液，向每管中加入處理后樣品或陰性對照(NTC)和陽性對照(BC-PTC)5μL，10000rpm瞬時離心10秒。
7.2 qPCR反應條件
將各反應管放入定量PCR儀器的反應槽內。
推薦循環條件:
1循環 50℃ for 2 min
預變性 1循環 95℃ for 10 min
PCR擴增 40循環 95℃ for 15 sec
60℃ for 60 sec
在60℃延伸時收集熒光信號。報告基團：設置為FAM。淬滅基團：NONE，請勿選擇ROX參比熒光。
組成及試劑配制:
1、酶標板：一(yi)塊(kuai)（96孔）
2、 標準(zhun)品(pin)（凍干品(pin)）： 2瓶(ping)，請臨用(yong)前15分(fen)(fen)(fen)鐘內配制。每(mei)瓶(ping)以(yi)樣品(pin)稀(xi)釋(shi)液稀(xi)釋(shi)至0.5ml，蓋好后(hou)室溫靜置大(da)約(yue)10分(fen)(fen)(fen)鐘，同時反復(fu)顛倒/搓動以(yi)助溶解，其濃度為200 U/L，然(ran)后(hou)做系列倍(bei)比稀(xi)釋(shi)（注：不要直(zhi)接在(zai)板中進行倍(bei)比稀(xi)釋(shi)），分(fen)(fen)(fen)別配制成200 U/L，100 U/L，50 U/L，25 U/L，12.5 U/L，6.25 U/L，3.12 U/L，樣品(pin)稀(xi)釋(shi)液直(zhi)接作(zuo)為空白孔 0 U/L。如(ru)配制100 U/L標準(zhun)品(pin)：取0.3ml （不要少(shao)于0.3ml ）200 U/L的上述標準(zhun)品(pin)加入含有0.3ml樣品(pin)稀(xi)釋(shi)液的Eppendorf管中，混勻即可，其余濃度以(yi)此類推。
3、 樣(yang)品稀釋液：1×20ml。
4、 檢測稀釋液(ye)A：1×10ml。
5、 檢測稀釋液B：1×10ml。
性成纖維生長因子6-吲哚

大內皮素-1（1-38），人1-丁基-甲基咪唑四氟酸鹽

大內皮素-1 （1-39），豬18-冠-6

腦鈉素-32，大鼠5-氨基-甲基-1,2,噻二唑

鈴蟾肽三叔丁氧基氫(qing)化(hua)鋁鋰(li)

緩激肽(S)-(-)-N-芐基-alpha-甲基芐

緩激肽（1-5）甲基-甲

緩激肽（1-6）氨基-三氟甲氧基甲

緩激肽（1-7）6--3,二氫-1H-2-萘酮

頰肽甲氧基(ji)噻吩

酸酶，雞環甲酸

降鈣素，人(S)-2-基-1-

降(jiang)鈣素(su)，大鼠芐氧羰(tang)酰基甘(gan)氨酸

降鈣素基因相關肽（8-37），人5-溴

降鈣素基因相關肽Ⅱ，人硫酸銨

降鈣素基因相關肽，大鼠2,3,三氟溴

蛋白酶1底物2m，熒光基-氟甲酸

蛋白酶3底物1m，熒光6-氨基-2-酚

ATP5AFST/FITC  熒光(guang)素標記抗卵泡抑素IgG20 ul

即刻早期基因ARCF1 operon positive regulatory proin(NT)/FITC  熒光素標記鼠疫耶爾森氏菌F1莢膜蛋白（N端）IgG100 ul

ADP核糖基(ji)化因子6F1 operon positive regulatory proin(CT)/FITC  熒(ying)光素標記鼠疫耶爾(er)森氏(shi)菌F1莢(jia)膜蛋白（C端）IgG20 ul

芳香化酶Gab1/FITC  熒光素標記兔抗、大、接頭蛋白Gab 1IgG100 ul

ArminGab2/FITC  熒(ying)光素標記接頭蛋白Gab 2IgG100 ul

alpha 1腎上腺素能受體APhospho-Gab1 (Tyr627) /FITC  熒光素標(biao)記兔抗、大、接頭蛋白Gab 1IgG1 ml

血管緊張素Ⅱ-1型受體Phospho-Gab1 (Tyr659) /FITC  熒光素標記兔抗、大、接頭蛋白Gab 1IgG100 ul

活化轉錄因子3GABA-AR Alpha1/FITC  熒光素標記γ1氨基丁酸受體α1IgG100 ul

血管緊縮素樣蛋白1GABA-B-R1/FITC  熒光素標記抗g-氨基丁酸B1受體IgG100 ul
大豆內源基因Lectin核酸試劑盒廠家1號染色(se)體(ti)開放(fang)閱讀(du)框(kuang)50抗體(ti)2,3-Dimethoxyxanthone中文(wen)名：2,3-二甲氧(yang)基呫(zhan)噸酮別名：分子式：C15H12O4

1號染色體開(kai)放閱讀框49抗體Swertianin 2-O-α-L- rhampyrasyl-(1→2)-β-D-xylopyraside中文名：別名：7-O-[α-L-Rhampyrasyl-(1→2)-β-D-xylo pyrasyl]-1,8-dihydroxy-3-methoxyxanthone分子式：C25H28O14

1號染(ran)色(se)體開放(fang)閱(yue)讀(du)框53抗體1,5-Dihydroxy-6,7-dimethoxyxanthone中(zhong)文名：1,5-二(er)羥基-6,7-二(er)甲氧基呫噸酮別名：分子(zi)式：C15H12O6

1號染色體(ti)開放閱讀框54抗體(ti)Symphone I中文名(ming)：別(bie)名(ming)：分子式：C38H48O6

1號染色(se)體(ti)開放(fang)閱讀(du)框55抗(kang)體(ti)Hyperxanthone中文名(ming)：別(bie)名(ming)：分子式：C18H14O5